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淋球菌營(yíng)養(yǎng)型與耐藥性及質(zhì)粒的關(guān)系

中華皮膚科雜志1998年第3期第31卷論著

作者：吳紅朱道銀

單位：400016重慶醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室

關(guān)鍵詞：淋病奈瑟菌；營(yíng)養(yǎng)型；微生物敏感性試驗(yàn)；質(zhì)粒

【摘要】目的為了解淋球菌的營(yíng)養(yǎng)型、耐藥性及質(zhì)粒之間的關(guān)系。方法對(duì)重慶市收集的83株淋球菌進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)型、抗生素敏感性和質(zhì)粒檢測(cè)。結(jié)果83株菌共分為8個(gè)營(yíng)養(yǎng)型，以Pro-型(51.8%)和Proto型(18.1%)為主。利用瓊脂稀釋法檢測(cè)菌株對(duì)青霉素、四環(huán)素和壯觀霉素的敏感性。青霉素耐藥株占15.6%，四環(huán)素耐藥株占70%，壯觀霉素耐藥株占1.2%。通過(guò)快速堿裂解法對(duì)其中的44株菌進(jìn)行質(zhì)粒檢測(cè)，70%菌株含24.5Md質(zhì)粒，80%含2.6Md質(zhì)粒，66%同時(shí)含24.5Md和2.6Md質(zhì)粒，16%未查到質(zhì)粒。并發(fā)現(xiàn)Pro-型菌株中青霉素耐藥株高于其它營(yíng)養(yǎng)型(P＜0.05)，且含24.5Md質(zhì)粒菌也顯著高于其它營(yíng)養(yǎng)型(P＜0.05)。含24.5Md+2.6Md質(zhì)粒菌株中四環(huán)素耐藥株更常見(jiàn)(P＜0.05)。檢測(cè)到1株產(chǎn)青霉素酶淋球菌(PPNG)，經(jīng)質(zhì)粒消除試驗(yàn)證實(shí)其耐藥性由4.4Md質(zhì)粒介導(dǎo)。結(jié)論本研究不僅表明了重慶地區(qū)淋球菌營(yíng)養(yǎng)型、耐藥性及質(zhì)粒的分布狀況，而且揭示了它們之間存在一定關(guān)系。這將對(duì)該地區(qū)淋球菌的流行病學(xué)調(diào)查和淋病防治提供幫助。

RelationshipBetweenAuxotypes,AntibioticSusceptibilitiesandPlasmidofNeisseriaGonorrhoeaeWuHong,ZhuDaoyin.DepartmentofMicrobiology,ChongqingUniversityofMedicalSciences,Chongqing400016

【Abstrant】ObjectiveToinvestigatetherelationshipbetweenauxotypes,antibioticresistanceandplasmidofNeisseriagonorrhoeae.Methods83isolatesofNeisseriagonorrhoeaefromChongqingduringtheperiodfromJanuary1994toNovember1995wereexamined.ResultsEightauxotypesweredetectedin83strains.Theprevalentauxotypeswereproline-requiringstrains(51.8%)andnonrequiring(18.1%).Theagardilutionmethodwasperformedtodetectthesusceptibilityof83isolatestopencillin,tetracyclineandspectinomycin,theresultsindicatedthat15.6%ofstrainswaspenicillinresistant,70%wastetracyclineresistant,1.2%wasspectinomycinresistant.Plasmidprofileof44isolates,whichwastestedbyrapidalkalineextractionmethod,showedthat70%ofthestrainscarried24.5Mdconjugativeplasmid,80%carried2.6Mdcrypticplasmid,66%carriedboth24.5Mdand2.6Mdplasmids,andnoplasmidwasfoundin16%ofthestrains.InPro-strainsbothpenicillinresistantstrainsand24.5Mdplasmidcarryingstrainsweremorecommonthanotherauxotypes(P＜0.05).Tetracyclineresistantstrainsweremorecommoninthanotherstrains(P＜0.05)instrainscontaining24.5Mdand2.6Mdplasmids.One(PPNG)strainwasdetectedandits4.4Mdplasmidencodingβ-lactamasewasdeterminedbyplasmideliminationtest.ConclusionThisstudyshowsnotonlythedistributionofauxotypes,antibioticresistanceandplasmidprofile,butalsosuggestscertainrelationshipbetweenthem.Itmaybehelpfulintheepidemiologicalsurveyaswellascontrolofgonorrheainthatarea.

【Keywords】NeisseriagenorrhoeaeAuxotypeMicrobialsensitivitytestsPlasmid

淋球菌營(yíng)養(yǎng)分型是根據(jù)菌株生長(zhǎng)對(duì)氨基酸、堿基等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求不同而進(jìn)行分型的一種方法，廣泛用于淋球菌流行病學(xué)調(diào)查。我們對(duì)重慶地區(qū)淋球菌作了這方面調(diào)查，以作淋病防治的重要參考。

材料和方法

(一)菌株來(lái)源：于1994年1月至1995年11月從本校第一附屬醫(yī)院門(mén)診病例中分離。83株菌中來(lái)自男性63株，女性20株。常規(guī)分離培養(yǎng)及鑒定，置甘油胰酶大豆肉湯中-70℃保存。

(二)營(yíng)養(yǎng)分型：方法詳見(jiàn)文獻(xiàn)［1］，即分別制備完全的NEDA(Neisseria-definedagar)和不完全NEDA培養(yǎng)基。6種不完全NEDA分別從完全NEDA中抽去以下成分：精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)、甲硫氨酸(Met)、半胱氨酸和胱氨酸(Cys)、尿嘧啶(Ura)、次黃嘌呤(Hyx)。接種約103～104cfu的細(xì)菌于各不完全及完全NEDA和淋球菌分離培養(yǎng)基(對(duì)照)，37℃燭缸培養(yǎng)48小時(shí)觀察結(jié)果。在完全培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而在缺乏某一成分的培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)為某一營(yíng)養(yǎng)缺陷型，分別記為Arg-、Pro-、Met-、Cys-、Ura-、Hyx-型。在所有營(yíng)養(yǎng)分型培養(yǎng)基上均生長(zhǎng)者為原養(yǎng)型即Proto(non-requiring)。

(三)抗生素敏感性檢測(cè)：采用瓊脂倍比稀釋法測(cè)定藥物的最低抑菌濃度(MIC)。測(cè)定的藥物濃度為青霉素4～0.015mg/L，四環(huán)素為16～0.125mg/L，壯觀霉素為128～2mg/L。將青霉素MIC≥1mg/L、四環(huán)素MIC≥2mg/L、壯觀霉素MIC≥64mg/L定為耐藥。采用WHO標(biāo)準(zhǔn)菌株A、B、C、D、E作為質(zhì)控菌株。

(四)青霉素酶的測(cè)定：采用紙片酸度定量法測(cè)定。用產(chǎn)酶金黃色葡萄球菌作陽(yáng)性對(duì)照。

(五)質(zhì)粒檢測(cè)：采用快速堿裂解法提取質(zhì)粒［2］。

(六)質(zhì)粒消除試驗(yàn)［3］：在含次MIC氟哌酸的肉湯管中加入細(xì)菌103～102cfu/ml，培養(yǎng)24小時(shí)后，影印培養(yǎng)在含4mg/L青霉素培養(yǎng)基不生長(zhǎng)、在不含藥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落為失去耐藥質(zhì)粒的菌落。并測(cè)其β-內(nèi)酰胺酶和提取質(zhì)粒以觀察質(zhì)粒帶變化。

結(jié)果

(一)營(yíng)養(yǎng)分型：83株淋球菌共分8個(gè)營(yíng)養(yǎng)型，其中Pro-型43株(51.8%)，Proto型15株(18.1%)，Arg-型7株(8.5%)，Pro-Hyx-型6株(7.2%)，Pro-Arg-型6株(6%)、Pro-Arg-Hyx-型3株(3.6%)，Hyx-2株(2.4%)，Arg-Hyx-2株(2.4%)。所有菌株生長(zhǎng)均需Cys。營(yíng)養(yǎng)型分布無(wú)患者性別差異。

(二)藥物的敏感性測(cè)定結(jié)果：83株淋球菌中，青霉素耐藥株占15.6%，四環(huán)素耐藥株為70%，壯觀霉素耐藥株為1.2%。所有菌株的MIC分布見(jiàn)附表。檢測(cè)到一株P(guān)PNG，其青霉素MIC≥8mg/L。

附表83株淋球菌對(duì)抗生素的MIC

抗生素抗生素濃度(mg/L)0.030.060.1250.250.51248163264128青霉素6418251744230000四環(huán)素00614148192110000壯觀霉素0000004183028201(三)質(zhì)粒分布概況：對(duì)83株淋球菌中的44株進(jìn)行質(zhì)粒檢測(cè)，共分6種質(zhì)粒類(lèi)型，即24.5+2.6Md(Megadalton)；24.5Md；2.6Md；25.2+2.6Md；24.5+4.4Md和不含質(zhì)粒菌株。含24.5Md菌株占70%，含2.6Md菌株為80%，無(wú)質(zhì)粒菌為16%，同時(shí)含24.5+2.6Md菌株占66%，含25.2+2.6Md和24.5+4.4Md菌各一株。含24.5+4.4Md菌為PPNG。(四)營(yíng)養(yǎng)型與耐藥性的關(guān)系：83株淋球菌中，Pro-型43株，其它營(yíng)養(yǎng)型40株，其中青霉素耐藥菌分別為10株和3株，說(shuō)明青霉素耐藥株主要分布在Pro-型中，經(jīng)χ2檢驗(yàn)有顯著性差異(χ2=3.894，P＜0.05)。四環(huán)素耐藥株廣泛分布于各營(yíng)養(yǎng)型中，無(wú)明顯型別差異。耐壯觀霉素和PPNG各一株均為Pro-型。

(五)營(yíng)養(yǎng)型與質(zhì)粒的關(guān)系：經(jīng)質(zhì)粒檢測(cè)的44株菌中，Pro-型19株，其中含24.5Md質(zhì)粒17株，其它營(yíng)養(yǎng)型的菌株共25株含24.5Md質(zhì)粒14株，經(jīng)χ2檢驗(yàn)顯示Pro-型菌株含24.5Md質(zhì)粒顯著高于其它型別(χ2=5.8109，P＜0.05)。

(六)質(zhì)粒與耐藥性關(guān)系：經(jīng)質(zhì)粒檢測(cè)的44株菌中，含24.5+2.6Md質(zhì)粒菌29株，其它質(zhì)粒類(lèi)型菌株為15株，它們中四環(huán)素耐藥株分別為18株和4株，經(jīng)χ2檢驗(yàn)顯示含24.5+2.6Md質(zhì)粒菌中四環(huán)素耐藥性增加(χ2=4.956，P＜0.05)。

1株P(guān)PNG經(jīng)質(zhì)粒消除后，β-內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)轉(zhuǎn)陰、青霉素MIC＜0.5mg/L，質(zhì)粒分析該菌僅含24.5Md質(zhì)粒帶，4.4Md帶消失。

討論

Catlin于1973年首先建立起較完整的營(yíng)養(yǎng)分型方法，該方法穩(wěn)定、重復(fù)性好，已廣泛用于淋球菌的分類(lèi)。如同時(shí)進(jìn)行耐藥性和質(zhì)粒檢測(cè)，則更能精確反映菌株的流行病學(xué)特征，并對(duì)淋病的監(jiān)測(cè)、治療和評(píng)估療效提供可靠依據(jù)。本文營(yíng)養(yǎng)分型以Pro-型和Proto型為主，分布類(lèi)似東南亞地區(qū)。而在歐美則以AHU-(Arg-Hyx-Ura-)為主，近年日本AHU菌株有上升趨勢(shì)［4］。我們未檢測(cè)到AHU-菌株，與葉順章等［5］發(fā)現(xiàn)一致。

1992年本室報(bào)道了重慶地區(qū)營(yíng)養(yǎng)型中Pro-、Proto型分別為25%、12.5%［6］；1995年即本次試驗(yàn)檢出它們各增至51.8%、18.1%，特別是Pro-型增長(zhǎng)最多，經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間的觀察，推測(cè)Pro-型為本地區(qū)持續(xù)存在菌株，可在本地區(qū)廣泛傳播。

本地區(qū)淋球菌四環(huán)素耐藥株多達(dá)70%。這可能與臨床上用四環(huán)素治療淋病和沙眼衣原體感染有關(guān)。青霉素耐藥株1990年為21.1%，本次檢測(cè)為15.6%。青霉素耐藥性無(wú)明顯增加趨勢(shì)，可能與近年少用青霉素治療淋病有關(guān)。PPNG從1990年的7.1%降至現(xiàn)在的1.2%。日本近年也報(bào)道PPNG下降，認(rèn)為可能與廣泛使用喹諾酮類(lèi)抗菌藥有關(guān)。壯觀霉素耐藥菌少見(jiàn)，提示臨床上仍可首選壯觀霉素治療淋病。

我們僅發(fā)現(xiàn)1株P(guān)PNG，經(jīng)質(zhì)粒消除后，β-內(nèi)酰胺酶轉(zhuǎn)陰，青霉素MIC＜0.5mg/L，4.4Md質(zhì)粒帶消失，說(shuō)明4.4Md質(zhì)粒為青霉素耐藥質(zhì)粒屬亞洲型質(zhì)粒。消除質(zhì)粒后變?yōu)榍嗝顾孛舾兄?，揭示該菌株耐藥僅由質(zhì)粒介導(dǎo)，與染色體突變無(wú)關(guān)。

多數(shù)研究認(rèn)為AHU-菌株大多對(duì)青霉素和四環(huán)素高度敏感，PCU-(Pro-Cit-Ura-；Cit瓜氨酸)菌株對(duì)青霉素中度敏感，其它型別的抗生素敏感性依各地區(qū)而異［7］。本文結(jié)果顯示Pro-菌株青霉素耐藥性顯著高于其他型別，這可能與本地區(qū)Pro-型菌株廣泛流行有一定關(guān)系。

據(jù)報(bào)道PPNG多屬Pro-型和Proto型，含3.2Md質(zhì)鑿PPNG常為Proto型；含4.4Md質(zhì)粒PPNG常為Pro-型［8］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1株P(guān)PNG，含4.4Md質(zhì)粒屬Pro-型。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)Pro-菌株含24.5Md質(zhì)粒的比例顯著高于其它型別，這使得重慶優(yōu)勢(shì)菌Pro-型菌株中青霉素耐藥質(zhì)粒更易在細(xì)菌間傳播。

參考文獻(xiàn)

1CatlinBW.NutritionalprofilesofNeisseriagonorrhoeae,NeisseriameningitidisandNeisserialactamicainchemicallydefinedmediaandtheuseofgrowthrequirementsforgonococcaltyping.JInfectDis,1973,128∶178-194.

2J.薩姆布魯克.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.北京:科學(xué)出版社,1992.19.

3李立津,王哲,胡文芝.氟哌酸和黃連素對(duì)志賀氏菌耐藥質(zhì)粒消除研究.中華傳染病雜志,1994,12∶4-7.

4NishimuraM,KumamotoY,HiroseT,etal.BacteriologicstudiesonNeisseriagonorrhoeaeisolatedinSapporo,Japan:Investigationofβ-lactamaseproductionandauxotypes.SexTransmDis,1991,18∶80-83.

5葉順章,王千秋,張傳福,等.淋球菌營(yíng)養(yǎng)分型方法的建立和72株淋球菌的分型結(jié)果.中華皮膚科雜志,1993,26∶139-141.

6朱道銀,王毅,李偉,等.重慶市淋球菌營(yíng)養(yǎng)型分布與變化.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,1993,13∶25-26.

7AgarwalSK,DebM,PrakashK,etal.AuxotypingofNeisseriagonorrhoeaeasanadditionalepidemiologicalmarker.IndianJMedRes,1992,95∶227-229.

8LindI,ArborioM,BentzonMW,etal.TheepidemiologyofNeisseriagonorrhoeaeisolatesinDakar,Senegal1982-1986:antimicrobialresistance,auxotypesandplasmidprofiles.GenitournMed,1991,67∶107-113.

（責(zé)任編輯：zxwq）

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