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白癜風(fēng)角朊細胞內(nèi)皮素-1mRNA表達的研究

中華皮膚科雜志1998年第4期第31卷論著

作者：常建民朱鐵君馬圣清

單位：100044北京醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院皮膚科［常建民(現(xiàn)在北京醫(yī)院皮膚科100730)朱鐵君］；北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科(馬圣清)

關(guān)鍵詞：白癜風(fēng)；角蛋白細胞；內(nèi)皮縮血管肽類

【摘要】目的了解白癜風(fēng)黑素細胞的消失與角朊細胞產(chǎn)生的內(nèi)皮素-1(ET-1)水平的關(guān)系。方法采用原位雜交的方法檢測了14例進展期尋常型白癜風(fēng)患者表皮角朊細胞ET-1mRNA表達。結(jié)果白癜風(fēng)患者白斑區(qū)及白斑邊緣角朊細胞ET-1mRNA表達明顯降低。結(jié)論白癜風(fēng)的發(fā)生可能與角朊細胞所分泌的ET-1等生長因子缺乏有關(guān)，角朊細胞ET-1表達水平降低的原因以及在白癜風(fēng)發(fā)病中作用尚需進一步研究。

StudyontheExpressionofEndothelin-1mRNAinKeratinocytesinPatientswithVitiligoChangJianmin,ZhuTiejun,MaShengqing.DepartmentofDermatology,People′sHospitalofBeijingMedicalUniversity,100044

【Abstract】ObjectiveTostudytheexpressionofendothelin-1(ET-1)mRNAinkeratinocytesinpatientswithvitiligo.MethodsFourteenpatientswithprogressivevitiligoweremeasuredbyhybridizationinsitu.ResultsOurresultsshowedthattheexpressionofET-1mRNAwasmarkedlydecreased.ConclusionTheresultsrevealedthatdecreasedET-1expressionmaybeassociatedwiththepathogenesisofvitiligo.ThecauseandroleofdecreasingofET-1expressionofkeratinocyteinvitiligolesionneedtobestudiedfurther.

【KeyWords】VitiligoKeratinocytesEndothelins

內(nèi)皮素-1(endothelin-1,ET-1)是由21個氨基酸殘基組成的強血管收縮肽，在維持人體系統(tǒng)及外周血管張力中起重要作用。ET-1還是許多細胞的促分裂劑，研究表明，角朊細胞能合成分泌ET-1并為黑素細胞的促分裂因子。我們應(yīng)用地高辛標(biāo)記的ET-1RNA探針采用原位雜交的方法對白癜風(fēng)角朊細胞ET-1mRNA表達進行了檢測，以了解角朊細胞ET-1mRNA表達與白癜風(fēng)發(fā)生的關(guān)系。

材料和方法

一、標(biāo)本來源及制作

白癜風(fēng)患者組：共14例，均為臨床診斷明確的進展期尋常型白癜風(fēng)患者(診斷根據(jù)全國色素病學(xué)組制定的診斷標(biāo)準(zhǔn))。其中男10例，女4例；年齡18～56歲；病程3個月至20年；其中散發(fā)型12例，泛發(fā)型2例。所有患者近1個月內(nèi)未接受皮質(zhì)類固醇激素、免疫抑制劑、紫外線、光敏藥物治療，也未接受其它系統(tǒng)藥物治療；正常對照組：共8例，其中男女各4例，年齡18～61歲。所有皮膚標(biāo)本均取于胸腹部，常規(guī)手術(shù)活檢取材。白癜風(fēng)組中，其中4例在白斑區(qū)、白斑邊緣(白斑向外2～5mm白斑向正常皮膚移行處)取材，10例在白斑區(qū)、白斑邊緣、白斑對側(cè)且至少遠離白斑10cm處正常皮膚處活檢取材。正常人皮膚標(biāo)本取自于胸腹部手術(shù)切口處。皮膚組織取下后立即置于10%的中性福爾馬林溶液中固定24小時，脫水，石蠟包埋。切片厚為5μm，覆于涂有Apes的載玻片上，置于65℃的烤箱中烤片40分鐘。

二、ET-1RNA探針的制備

ET-1重組質(zhì)粒由北京醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系分子病理實驗室提供。ET-1片段為1.1kb。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌，進行質(zhì)粒擴增，然后堿變性法提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ將質(zhì)粒DNA線性化。在T７RNA聚合酶作用下體外轉(zhuǎn)錄合成地高辛標(biāo)記的反義RNA探針，在SP６RNA聚合酶的作用下合成正義探針。

三、原位雜交

具體步驟如下：切片于二甲苯中脫蠟1小時，3次，然后于100%、90%、85%乙醇中水化，PBS清洗。切片組織上滴加0.1NHCl，室溫下10分鐘，然后PBS沖洗。組織在37℃用100μg/ml的蛋白酶K消化10分鐘。PBS沖洗后，室溫下吹干。滴加雜交液。在Ep管中每張切片加入下列成分：ET-1RNA探針2μl，去離子甲酰胺10μl，SSD1μl，50×Denhardts2μl，硫酸葡聚糖2μl，1mol/LDTT1μl，20×SSC4μl，上述成分混勻后于80℃～90℃水浴中放置5分鐘，然后滴于切片組織上，每張切片滴加20μl。切片置于盛有甲酰胺的濕盒中，42℃雜交16～20小時。雜交后2×SSC浸洗15分鐘，2次，然后用1∶1000RNase室溫下消化5分鐘。1×SSC浸洗15分鐘，2次后，地高辛緩沖液Ⅰ浸洗5分鐘。用地高辛緩沖液Ⅰ1∶100稀釋的馬血清37℃封閉30分鐘。加用地高辛緩沖液Ⅰ1∶500稀釋的地高辛抗體，37℃，30分鐘。用地高辛緩沖液Ⅰ浸洗15分鐘，2次后，用地高辛緩沖液Ⅲ浸洗3分鐘，2次。滴加用地高辛緩沖液Ⅲ1∶100稀釋的BCIP/NBT，避光顯色15～30分鐘。終止顯色，二甲苯透明，封片。陽性結(jié)果判定：胞漿中出現(xiàn)藍紫色信號為染色陽性。正義探針作陰性對照。

四、圖像分析及統(tǒng)計學(xué)處理

采用MPI-400計算機多媒體彩色圖文分析系統(tǒng)(同濟太陽公司)對切片上的染色信號進行灰度分析。每個切片組織隨機選取3個視野，測量單位面積平均灰度值?；叶戎荡硇盘柋磉_強度。各組之間平均灰度值差別采用方差分析。

結(jié)果

光鏡下觀察：白癜風(fēng)患者白斑區(qū)、白斑邊緣角朊細胞與白斑對側(cè)皮膚角朊細胞(圖1)及正常人皮膚角朊細胞(圖2)比較，白斑區(qū)、白斑邊緣角朊細胞ET-1mRNA表達明顯降低。白斑區(qū)與白斑邊緣角朊細胞比較，白斑區(qū)角朊細胞ET-1mRNA表達低。白斑對側(cè)皮膚角朊細胞與正常人皮膚角朊細胞ET-1mRNA表達未見差別。

圖1白癜風(fēng)患者白斑區(qū)、白斑邊緣、白斑對側(cè)角朊細胞

ET-1mRNA表達

圖2正常人皮膚角朊細胞ET-1mRNA表達

原位雜交染色經(jīng)計算機圖像分析，測量灰度值，各組間平均灰度值進行統(tǒng)計學(xué)檢驗，白斑區(qū)角朊細胞組(143.5±3.7)及白斑邊緣角朊細胞組(158.6±6.1)平均灰度值明顯低于白斑對側(cè)皮膚角朊細胞組(183.5±6.5)及正常人皮膚角朊細胞組(177.4±4.3)(P＜0.05)；白斑區(qū)角朊細胞組平均灰度值明顯低于白斑邊緣角朊細胞組(P＜0.05)；白斑對側(cè)皮膚角朊細胞組與正常人皮膚角朊細胞組平均灰度值無顯著性差異(P＞0.05)。

討論

角朊細胞(KC)和黑素細胞(MC)是表皮中的兩種主要細胞。白癜風(fēng)的主要病理改變是表皮內(nèi)的MC死亡消失［1］。MC死亡消失的機理尚不清楚。近年來體外研究發(fā)現(xiàn)KC對MC的生長分化有重要作用。KC不僅能特異地刺激MC生長，還能促進MC色素形成及樹突生長［2～5］。KC對MC的作用機制，主要是通過KC產(chǎn)生一些生長因子來影響MC的生長、分化。

本實驗研究對象均為進展期白癜風(fēng)患者，不僅檢測白斑區(qū)KC表達ET-1水平，對白斑邊緣、白斑對側(cè)皮膚KC的表達水平亦進行檢測。實驗發(fā)現(xiàn)進展期白癜風(fēng)白斑區(qū)及白斑邊緣KC的ET-1mRNA表達較白斑對側(cè)及正常人皮膚KC低，且以白斑區(qū)KC降低更為明顯。白斑區(qū)KC比白斑邊緣KC的ET-1mRNA表達低，白斑邊緣KC的ET-1mRNA表達較白斑對側(cè)及正常人皮膚KC低，這一結(jié)果符合進展期白癜風(fēng)由白斑向邊緣的疾病發(fā)展過程。進展期白癜風(fēng)白斑區(qū)及白斑邊緣KC的ET-1mRNA表達比正常人KC低，也進一步證實了白癜風(fēng)白斑及白斑邊緣KC的異常。白癜風(fēng)白斑區(qū)、白斑邊緣KC表達ET-1顯著低下的原因以及KC表達ET-1低下在白癜風(fēng)發(fā)生中所起的作用及其相互的關(guān)系尚需進一步研究。

參考文獻

1PooleCL,WilingardR,WesterhofW,etal.Presenceorabsenceofmelanocytesinvitiligolesions:animmunohistochemicalinvestigation.JInvestDermatol,1993,100∶816-822.

2DelucaM,D′AnnaF,BondanzaS,etal.Humanepithelialcellsinducehumanmelanocytesgrowthinvitrobutonlyskinkeratinocytesregulateitsproperdifferentiationintheabsenceofdermis.JCellBiol,1988,107∶1919-1926.

3HalabanR,LangdonR,BirchallN,etal.Basicfibroblastgrowthfactorfromhumankeratinocyteisanaturalmitogenformelanocytes.JCellBiol,1988,107∶1611-1619.

4GordonPR,MansurCP,GilchrestBA.Regulationofhumanmelanocytegrowth,dendricity,andmelanonizationbykeratinocytederivedfactors.JInvestDermatol,1989,92∶565-572.

5杜娟,朱鐵君.尋常型進展期白癜風(fēng)的超微結(jié)構(gòu)變化.中華皮膚科雜志,1996,29∶240-242.

(收稿：1997-07-14修回：1997-12-01)

（責(zé)任編輯：zxwq）

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