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流式細(xì)胞分析梅毒患者外周血T淋巴細(xì)胞的免疫表型

中華皮膚科雜志1998年第3期第31卷論著

作者：錢黎華王俠生楊蜀嵋徐金華閆永寧徐明

單位：200040上海醫(yī)科大學(xué)華山醫(yī)院皮膚科

關(guān)鍵詞：梅毒；淋巴細(xì)胞免疫表型；流式細(xì)胞計(jì)數(shù)

【摘要】目的研究人類對(duì)梅毒螺旋體的細(xì)胞免疫反應(yīng)特征，分析進(jìn)入血液后的梅毒螺旋體對(duì)機(jī)體外周血中各淋巴細(xì)胞亞群及自然殺傷細(xì)胞(NK)的影響情況。方法通過流式細(xì)胞儀，運(yùn)用標(biāo)有異硫氰酸熒光素(FITC)或藻紅素(PE)的CD單抗，分析了24例未經(jīng)驅(qū)梅治療過的早期梅毒患者(含泛發(fā)型皮疹、掌跖型皮疹及無皮疹型各8例)外周血中各T淋巴細(xì)胞免疫表型的特點(diǎn)。結(jié)果24例梅毒患者的外周血中總T、TH、NK細(xì)胞及TH/Ts的比值均明顯低于正常人對(duì)照組(P＜0.01)，而Ts的比例則顯著高于正常人對(duì)照組(P＜0.01)；另外皮疹呈泛發(fā)型、掌跖型、無皮疹型三組患者在上述免疫表型的比例方面相互比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論未經(jīng)驅(qū)梅治療過的早期梅毒患者存在著明顯的細(xì)胞免疫抑制，其中皮疹呈泛發(fā)型、掌跖型、無皮疹型三者基本上反映了進(jìn)入血液后的梅毒螺旋體在不同皮膚屏障功能下的表現(xiàn)形式，而與機(jī)體外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的變化之間無明顯的相關(guān)關(guān)系。

AnalysisofPeripheralBloodLymphocyteImmunophenotypesinSyphiliticPatientswithFlowCytometryQianLihua,WangXiasheng,YangShumei,etal.DepartmentofDermatology,HuashanHospital,ShanghaiMedicalUniversity,Shanghai200040

【Abstract】ObjectiveTocharacterizethehumancell-mediatedimmuneresponsetoTreponemapallidum(TP),andtodeterminetheeffectofTPinfectiononthevariouslymphocytesubpopulationsandnaturalkillercellsintheperipheralbloodofthepatients.MethodsTwenty-fouruntreatedpatientswithearlysyphiliswereanalyzed,including3groupsof8patientswithdisseminatedsyphilides,palmoplantarsyphilidesandlatentsyphiliseach.MonoclonalantibodiesofCDlabeledwitheitherfluoresceinisothiocyanateorphycoerythrinwereusedonaflowcytometrytodetectthechangingofperipheralbloodlymphocyteimmunophenotypes.ResultsTheresultsshowedthatthepercentagesofpanT,TH,NKcellsandtheratioofTH/TSweresignificantlylower(P＜0.01)andthoseofTScellsweresignificantlyhigher(P[WTBZ＜0.01)thanthoseofnormalcontrols.Nostatisticaldifferenceoftheimmunophenotypedistributionwasfoundamonggroupsofdisseminatedlesions,palmoplantarsyphilides,andlatentsyphilis(P0.05).ConclusionItsuggeststhatthereisprominentsuppressionofcellularimmunityintheuntreatedpatientssufferingfromearlysyphilis.Meanwhile,thedifferenceof3groupsinskinlesionswasduetothedifferentdermatobarrierfunctionagainstthesystemicinvasionofTP,ratherthanattributedtothealterationofthelymphocyteimmunophenotypesintheperipheralblood.

【Keywords】SyphilisLymphocyteimmunophenotypeFlowcytometry

人T淋巴細(xì)胞對(duì)梅毒螺旋體(TP)的免疫反應(yīng)極為重要［1，2］，但是進(jìn)入血液后的TP是如何影響機(jī)體外周血淋巴細(xì)胞亞群及自然殺傷細(xì)胞(NK)尚不清楚；臨床上所見到的泛發(fā)型、掌跖型、無皮疹型的早期梅毒，它們?cè)诩?xì)胞免疫方面是否存在差異，更鮮為人知。我們運(yùn)用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法來分析梅毒患者外周血淋巴細(xì)胞亞群及NK的特點(diǎn)，評(píng)價(jià)進(jìn)入血液后的TP對(duì)其影響的情況，從而探討人對(duì)TP的細(xì)胞免疫反應(yīng)特征，并進(jìn)一步揭示上述三型早期梅毒與機(jī)體淋巴細(xì)胞亞群及NK變化之間的關(guān)系。

病例和方法

(一)病例：共收集24例未經(jīng)驅(qū)梅治療過的早期梅毒患者，均來自我院性病門診，其中男13例，女11例；年齡20～46歲。臨床上有皮疹者16例(含泛發(fā)型、掌跖型皮疹各8例)，無皮疹的潛伏梅毒8例。實(shí)驗(yàn)室檢查示血清RPR及TPHA試驗(yàn)均陽性，而HIV初篩試驗(yàn)均陰性。另外以70例健康志愿者為對(duì)照組。

(二)流式細(xì)胞儀：采用型號(hào)為FACStarPLUS的流式細(xì)胞儀(美國BectonDickinson,BD公司)；其激光工作條件為采用Innova90-5氬離子激光器，功率為200mW，波長為488nm。

(三)試劑：?jiǎn)慰寺】贵w：Anti-Leu3(CD3)FITC、Anti-Leu4(CD4)FITC、Anti-Leu2a(CD8)PE及Anti-Leu11/19(CD16,56)PE(美國BD公司產(chǎn)品)，CD3+、CD4＋、CD8+、CD16,56+分別代表總T、TH、Ts、NK細(xì)胞。紅細(xì)胞溶解液：由KHCO31.0g、NH4Cl8.3g、EDTA-Na237mg；H2O1000mg組成(自行配制)。

(四)血液標(biāo)本：抽取用肝素抗凝的患者外周靜脈血2ml；免疫樣品制備前在4℃下保存。

(五)樣品制備：在上述抗凝全血中加入上述單抗各20μl，混合，在4℃下旋轉(zhuǎn)45分鐘；加入2ml紅細(xì)胞溶解液放置片刻，破紅細(xì)胞；離心1500r/min5分鐘，棄上清液；用PBS洗滌細(xì)胞2～3次，再懸浮于0.3mlPBS中，上機(jī)。從采標(biāo)本到上機(jī)在12小時(shí)內(nèi)完成。

(六)數(shù)據(jù)處理：用美國BD公司Lysis軟件，運(yùn)用t檢驗(yàn)及方差分析來對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

結(jié)果

(一)24例梅毒患者的外周血中總T淋巴細(xì)胞、TH、NK、TH/Ts的比例明顯低于正常人對(duì)照組，并且通過t檢驗(yàn)后示差異具有顯著性(P＜0.01)。而Ts則顯著高于正常人對(duì)照組(P＜0.01)，詳見表1。

(二)12例有皮疹的梅毒患者與8例無皮疹的潛伏梅毒患者在總T、TH、Ts、NK、TH/Ts的比例方面，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無顯著性(P0.05)；而且通過對(duì)皮疹呈泛發(fā)型及掌跖型的患者在總T、TH、Ts、NK、TH/Ts的比例方面的相互比較并經(jīng)方差分析后，差異亦無顯著性(P0.05)，詳見表2。

表1梅毒患者外周血各淋巴細(xì)胞免疫表型的均數(shù)范圍(±s，%)

組別例數(shù)總T(CD3+)TH（CD4+)Ts(CD8+)NK(CD16,56+)TH／Ts(CD4+/CD8+)正常人對(duì)照組7068.38±7.1742.66±5.4624.15±5.0519.73±6.451.75±0.50梅毒患者2462.91±11.3932.05±5.5232.15±8.1614.38±6.621.05±0.28t值-2.748.195.653.486.50P值-＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01表2皮疹分布不同的梅毒患者淋巴細(xì)胞免疫表型的均數(shù)范圍(±s，%)

組別例數(shù)總T(CD3+)TH（CD4+)Ts(CD8+)NK(CD16+,56+)TH／Ts(CD4+/CD8+)有皮疹型1663.49±10.4432.18±5.1532.97±8.6513.55±6.101.04±0.30泛發(fā)型866.32±11.4231.95±5.8737.00±10.0413.24±7.680.92±0.31掌跖型860.66±9.2032.41±4.7328.95±4.7513.86±4.541.15±0.27t值*-1.090.172.050.131.58P值-0.050.050.050.050.05無皮疹型861.75±13.8131.79±6.5630.50±7.3416.03±7.711.07±0.23t值-0.340.160.690.860.25P值-.＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05

*指掌跖型與泛發(fā)型患者的比較，**指有皮疹與無皮疹患者的比較討論

我們發(fā)現(xiàn)本組16例Ⅱ期梅毒患者及8例早期潛伏梅毒患者，其外周血中總的T淋巴細(xì)胞比例及TH比例明顯低于正常人對(duì)照組(P＜0.01)，這與Pope等［3］報(bào)道的結(jié)論一致。顯然血液中缺乏了致敏的T淋巴細(xì)胞，就不能形成由TH細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)TP抗原的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)，從而造成二期梅毒與潛伏梅毒的持續(xù)存在。另一方面不容忽視的是，本組24例梅毒患者外周血中Ts的比例明顯升高，以致于TH／Ts的比值顯著低于正常人對(duì)照組(P＜0.01)，說明Ts細(xì)胞的異常增殖不僅拮抗了TH細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)TP抗原的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)，而且也抑制了TP制動(dòng)抗體的形成，造成TP的繁殖與擴(kuò)散。同時(shí)本組患者中其外周血中的NK細(xì)胞在數(shù)量上亦明顯減少(P＜0.01)。這無疑也促進(jìn)了TP在血液中的繁殖。另外通過對(duì)有皮疹的(泛發(fā)型、掌跖型)與無皮疹的兩組患者外周血中總T、TH、Ts、NK、TH／Ts的比例方面的相互比較，發(fā)現(xiàn)差異亦無顯著性(P0.05)?？傊?，未經(jīng)驅(qū)梅治療過的早期梅毒患者，存在著明顯的細(xì)胞免疫抑制，盡管局部的免疫功能已能控制硬下疳，但宿主仍不能根除全身的TP感染，以致TP在體內(nèi)持續(xù)存在而造成疾病的活動(dòng)性與宿主的傳染性。

志謝中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所吳直江、高奇蓉老師

參考文獻(xiàn)

1Baker-ZanderSA,FohnMJ,LukehartSA.DevelopmentofcellularimmunitytoindividualsolubleantigensofTreponemapallidum[WTBZduringexperimentalsyphilis.JImmunol,1988,141∶4363-4369.

2WareJL,FoldJD,BasemanJB.ModulationofnormallymphocytestimulationbyserumfromTreponemapallidum-infectedrabbits.CellImmunol,1980,53∶29-38.

3PopeV,SandreAL,LarsenSA,etal.FlowcytometricofperipheralbloodlymphocyteimmunophenotypesinpersonsinfectedwithTreponemapallidum.ClinDiagnLabImmunol,1994,1∶121-124.

（責(zé)任編輯：zxwq）

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