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石蠟包埋組織中麻風(fēng)菌基因擴(kuò)增試驗(yàn)初探

中華皮膚科雜志2000年第0期第33卷論著

作者：吳勤學(xué)尹躍平張良芬余艷華侯偉葉干運(yùn)

單位：南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所210042

關(guān)鍵詞：分支桿菌；麻風(fēng)聚合酶鏈反應(yīng)

【摘要】目的建立用石蠟包埋組織中麻風(fēng)菌DNA進(jìn)行基因擴(kuò)增的試驗(yàn)。方法用Texpat試盒將石蠟切片脫蠟、破壁和釋放麻風(fēng)菌DNA并用100％乙醇沉淀純化DNA，用引物RPOT(F)和RPUT(R)進(jìn)行PCR。結(jié)果細(xì)菌指數(shù)大于1＋的33份石蠟包埋標(biāo)本，28份PCR陽(yáng)性，細(xì)菌指數(shù)為0的標(biāo)本PCR陰性。陰性對(duì)照呈陰性反應(yīng)，陽(yáng)性對(duì)照呈陽(yáng)性反應(yīng)，方法敏感度達(dá)0.04pgDNA水平。結(jié)論用本法可從福爾馬林固定的石蠟包埋組織切片中釋放麻風(fēng)菌DNA，并獲得滿意基因擴(kuò)增結(jié)果。

GeneAmplificationTestofMycobacteriumLepraeinParaffin－EmbeddedTissue

WUQinxueYINGYuepingZHANGLiangfenetal

（InstituteofDermatology,ChineseAcademyofMedicalSciences＆PekingUnionMedicalCollege,Nanjing210042）

【Abstract】ObjectiveToestablishapolymerasechainreaction(PCR)methodtoamplifyDNAofM.lepraefromfixedandparaffin－embeddedtissue(FPET).MethodsTheDNAofM.lepraewasreleasedfromFPETbyusingTexpatKitandpurifiedwith100％alcohol.TheprimersRPOT(1)andRPUT(2)wereusedtoconductthePCR.ResultsAtotalof32sampleswereexamined.Outof32sampleswithBIofmorethan1＋,28werepositiveforPCR.ThePCRwasnegativeinasamplewithBI=0.ThesensitivityofPCRreachedalevelof0.04pgDNA.ConclusionThisPCRmethodisveryusefulfor

amplifyingtheDNAofM.lepraefromFPET.

【Keyword】MycobacteriallepraePolymerasechainreaction

由于用石蠟包埋組織中麻風(fēng)菌進(jìn)行基因擴(kuò)增試驗(yàn)?zāi)艽蟠笸貙捖轱L(fēng)菌的研究范圍，特別是回顧性研究[1]，國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直試圖建立一個(gè)有效的方法，但由于既往組織在用石蠟包埋前多經(jīng)福爾馬林固定，為建立方法造成極大困難，所以至今國(guó)內(nèi)外罕見成功的報(bào)道。最近日本學(xué)者松岡等對(duì)之有較大的改進(jìn)[2]，參照他們的經(jīng)驗(yàn)，我們獲得初步成功，現(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報(bào)告于下。

材料和方法

一、材料及其來(lái)源

(一)患者材料：麻風(fēng)患者石蠟包埋組織。

(二)脫蠟及DNA提取劑：Texpat試盒，由日本國(guó)立感染病研究所多摩麻風(fēng)研究中心松岡氏提供。

(三)標(biāo)準(zhǔn)DNA及陽(yáng)性對(duì)照：標(biāo)準(zhǔn)麻風(fēng)菌DNA(Thai53來(lái)源)由日本大阪大學(xué)微生物系牧野提供，濃度為2.15mg/mL。陽(yáng)性對(duì)照為作者在日本多摩麻風(fēng)中心自行擴(kuò)增的被確認(rèn)的PCR產(chǎn)物。

(四)PCR引物為RPOT(F)(簡(jiǎn)稱P1)和RPUT(R)(簡(jiǎn)稱P2)，由日本多摩麻風(fēng)中心松岡氏提供。

二、方法

(一)模板DNA的制備：由石蠟包埋組織內(nèi)麻風(fēng)菌中提取與釋放DNA，其程序如下：將切片機(jī)用70％酒精清洗干凈，特別是刀片。取石蠟包埋組織(以下簡(jiǎn)稱蠟塊)將之切割成5μm厚切片置于1.5mLEppendorf管中，每管5片，盡置管底，向每管滴加Texpat液20滴，旋渦振蕩后，置100℃水浴10min，于12000r/min離心15min，小心取150μL上清液置另一備好的Eppendorf管中，按2倍體積加無(wú)水酒精，旋渦振蕩后置－72℃30min，于15000r/min離心15min，小心傾去上清液，管倒置自然干燥過(guò)夜或72℃水浴1h，或冷凍干燥30min或15000r/min真空離心30min，每管加入TE緩沖液50μL置－20℃?zhèn)溆谩?/p>(二)麻風(fēng)菌DNA擴(kuò)增和檢測(cè)：每管加已提取的麻風(fēng)菌DNA液1μL、dNTPs8μL、P12.5μL、P22.5μL、Taq酶0.5μL、5×Buffer10μL補(bǔ)DW至50μL。置于PTC－51B型PCR儀中，95℃10min，再按94℃90s，55℃90s，72℃120s總循環(huán)40次，最后72℃延伸10min，后取9μL擴(kuò)增產(chǎn)物在15％聚丙烯酰胺凝膠或4％Metaphor瓊脂糖電泳，用1％EB染色，在紫外檢測(cè)儀下觀察并照相記錄結(jié)果。

結(jié)果

(一)PCR檢測(cè)敏感度：用標(biāo)準(zhǔn)麻風(fēng)菌Thai53之不同稀釋度純DNA作模板，放大結(jié)果見圖1。在103處仍顯陽(yáng)性結(jié)果，相當(dāng)于0.04pg/μL水平DNA。

圖1PCR檢測(cè)敏感度

(二)PCR檢測(cè)石蠟包埋組織切片結(jié)果：總檢測(cè)標(biāo)本33份，4份陰性，29份陽(yáng)性。有2例BT亦為陽(yáng)性。我們?nèi)芜x7份標(biāo)本放大結(jié)果見圖2。

圖2PCR檢測(cè)石蠟包埋組織切片結(jié)果

(三)不同BI石蠟包埋組織切片的PCR檢測(cè)結(jié)果：32份切片中，PCR陽(yáng)性見于BI＞3(13份)，BI1～3(15份)；3份BI＞3，1份BI≤1PCR陰性。BI1～3的標(biāo)本全部檢出，BI＞3的標(biāo)本絕大部分檢出，BI≤1的標(biāo)本未檢出。表1結(jié)果提示PCR的檢出率與切片中菌荷量有一定關(guān)系。

表1不同保存時(shí)間石蠟包埋組織切片的PCR檢測(cè)結(jié)果

取材年代例數(shù)PCR陽(yáng)性PCR陰性距檢測(cè)時(shí)間不明321不明197611023年197711022年19912208年19965413年19976512年19981101年199913122*2～3個(gè)月合計(jì)32285*其中1例BI為0(四)不同保存時(shí)間石蠟包埋組織切片的PCR檢測(cè)結(jié)果：見表1。本結(jié)果以1999年為最近保存時(shí)間，保存最長(zhǎng)的是1976年和1977年的標(biāo)本(距今20年以上)，PCR檢測(cè)全為陽(yáng)性，其它時(shí)間段陰性與陽(yáng)性相間。在最短保存時(shí)間段里的標(biāo)本PCR檢測(cè)也有顯示陰性結(jié)果的，原因待討論。

討論

有關(guān)用石蠟包埋組織中麻風(fēng)菌進(jìn)行基因擴(kuò)增試驗(yàn)的報(bào)告罕見，以往許多學(xué)者曾作過(guò)嘗試[1]均未獲得成功。主要原因是大多石蠟包埋組織在包埋前經(jīng)福爾馬林固定降解了麻風(fēng)菌DNA,對(duì)PCR有抑制作用難獲成功[2]，且原來(lái)從石蠟包埋組織中提取麻風(fēng)菌DNA手續(xù)煩瑣且效率低。我們用石蠟包埋組織中麻風(fēng)菌進(jìn)行的基因擴(kuò)增試驗(yàn),結(jié)果表明含菌切片擴(kuò)增可獲滿意結(jié)果。這可能歸因于用Texpat試盒從石蠟切片提取DNA簡(jiǎn)單、快速而且效率很高；更主要的原因是松岡的引物高效且適于放大降解DNA[3]。本法的建立擴(kuò)大了PCR在麻風(fēng)的應(yīng)用和研究范圍，特別是作回顧性的研究有重要意義[4]。在當(dāng)代收集適于研究用的新鮮活檢標(biāo)本較為困難的情況下尤為重要。用本法使有計(jì)劃大規(guī)模地回顧性研究(如麻風(fēng)菌的基因分型和分布，耐藥菌株抵抗的分子機(jī)理的研究等)成為可能。

在進(jìn)行試驗(yàn)過(guò)程中結(jié)合我國(guó)的實(shí)際情況，將松岡方法作了一些變動(dòng)，如將高速真空離心步驟改為自然干燥，PCR敏感度仍達(dá)0.04pg/μL水平(圖1)，這樣不但解決了必須采用高級(jí)設(shè)備的問(wèn)題，而且更易推廣使用。我們的實(shí)驗(yàn)表明此步如改為72℃水浴1～2h，或冷凍干燥30min至1h，亦可獲得滿意結(jié)果；將4％Metaphor瓊脂糖電泳改為15％聚丙烯酰胺凝膠電泳，不但獲得了滿意的結(jié)果，而且節(jié)約了經(jīng)費(fèi)。

參考文獻(xiàn)

1，WorkshoponPCRtechnologyforthedetectionofM.leprae.Thailand:April1991.8－19.

2，PierardPE.Thepolymerasechainreactionmethodandapplicationsindermatology,ExpDermatol,1993,15(2):118－126.

3，松岡正典,前田伸司，甲斐雅規(guī)，他.らハ菌rPOT遺子の多型性之の地理分布.JapaneseJLepr,1999,68:51.

4，黃培堂,俞煒源,陳添等譯.PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南.北京:北京科學(xué)技術(shù)出版社,1998.59.

(收稿日期：1999－12－10)

（責(zé)任編輯：zxwq）

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