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陰道念珠菌菌株的分型和相似性分析

中華皮膚科雜志1998年第5期第31卷論著

作者：秦振宇姚聰君譚升順吳紹熙

單位：210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所［秦振宇吳紹熙(指導(dǎo)者)］；西安醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院［姚聰君譚升順(指導(dǎo)者)］

關(guān)鍵詞：念珠菌；生化反應(yīng)；染色

【摘要】目的探討陰道念珠菌病發(fā)病與念珠菌菌株的關(guān)系。方法選擇兩組白念珠菌，A組來源于健康婦女陰道分泌物，B組來源于陰道念珠菌病患者。選用自動微生物診斷鑒別系統(tǒng)和氨基黑染色法兩種表型識別技術(shù)檢測受檢菌株生化反應(yīng)及蛋白酶分泌參數(shù)，進(jìn)而用數(shù)值分類技術(shù)行相似性分析。結(jié)果A、B兩組間福壽草醇存在顯著性差異(P＜0.05)，也進(jìn)一步證實蛋白酶的分泌能力在兩組間存在顯著性差異(P＜0.01)。56株白念珠菌共產(chǎn)生41型，可大致分為7類，c、f和g類以B組分離株為主，b和d類以A組分離株為主。結(jié)論福壽草醇和蛋白酶的升高可能與陰道念珠菌病發(fā)病相關(guān)。數(shù)值分類技術(shù)在菌株相似性分析時，有其優(yōu)越性，有待進(jìn)一步總結(jié)。

ClassificationandAnalogousAnalysisofCandidaStrainsIsolatedfromVulvovaginalCandidiasisQinZhenyu,YaoCongjun,TanShengshun,etal.InstituteofDermatology,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Nanjing210042

【Abstract】ObjectiveTostudythecorrelationbetweenCandidastrainsandvulvovaginalcandidiasis.MethodsTwogroupsofCandidaalbicansstrainswerechosen.StrainsofgroupAandgroupBwereisolatedfromvaginaldischargeofnormalwomenandofpatientswithcandidalvaginitisrespectively.Thetwomethods,AMS(automatedmicrobiologicaldetectionandidentificationsystem)andaminoblackstain,wereappliedtodetecttwophenotypicparameters,biochemicalreactionofthestrainsandsecretorycapacityoftheproteinasesrespectively,andanalogousanalysiswasperformedthen.ResultsTherewasasignificantdifferenceinthelevelsofadonitol(P＜0.05)betweengroupAandB,andfurtherstudyprovedthatthedifferenceinthesecretorycapacityofproteinasewassignificantbetweenthem([WTBX〗P＜0.01).Byusingthemethodofanalogousanalysis,56strainsofCandidaalbicanswereclassifiedinto41types,andcouldbeapproximatelydividedinto7sub-groups.Thestrainsinthesub-groupc,fandgweremainlyingroupBandthesub-groupbanddmainlyingroupA.ConclusionIncreaseinthelevelsofadonitolandproteinasemayberelatedtothedevelopmentofvulvovaginalcandidiasis.Atthesametime,theadvantageofusingnumericaltaxonmictechniqueinstratinanalysisisdiscussed.

【Keywords】CandidaBiochemicalreactionStaining

目前，對陰道念珠菌病研究主要集中于患者因素，對菌株因素的研究報道較為少見。菌株間表型或基因型的差異也可能產(chǎn)生不同的致病性。為此，我們應(yīng)用自動微生物診斷鑒別系統(tǒng)(AMS)、氨基黑染色法兩種技術(shù)檢測了陰道念珠菌病患者和正常人陰道分離白念珠菌的碳源同化及蛋白酶分泌，對此問題做了一些探討。

材料和方法

一、菌株來源、鑒定及保存

菌株分為A和B兩組，A組菌株來源于205例健康婦女陰道分泌物，陽性22例(10.7%)，編號1～22；B組菌株來源于33例陰道念珠菌病患者，陽性33例(100%)，編號24～56。取材時，分別以無菌生理鹽水棉簽擦拭被檢者陰道后，接種于含氯霉素(50μg/ml)的葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基表面，置30℃恒溫培養(yǎng)3天后觀察結(jié)果，若無生長可觀察最長至兩周。標(biāo)準(zhǔn)菌株白念珠菌ATCC10231(西安醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院細(xì)菌室提供)，編號23。菌落分純2次，經(jīng)常規(guī)方法鑒定為白念珠菌后，蒸餾水中保存于-20℃?zhèn)溆谩０啄钪榫某Ｒ?guī)鑒定包括沙堡培養(yǎng)基(SDA)上的典型菌落顏色和形態(tài)；玉米粉瓊脂培養(yǎng)基上長出的頂端圓形厚壁孢子；人血清芽管形成實驗陽性。同時參考酵母生化卡(YBC,BioMerieuxVitek,Inc,USA)中半乳糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖和葡萄糖同化反應(yīng)結(jié)果。

二、AMS檢測白念珠菌對26種碳源的同化能力［1］

1.碳源同化反應(yīng)：YBC含有30個反應(yīng)池，其中26個為同化反應(yīng)池，4個為對照池。用于同化試驗的26種碳源包括半乳糖、蔗糖、麥芽糖、卟拉醇(palations)、葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖、落葉糖、衛(wèi)矛醇、紅鮮醇、木質(zhì)糖、閔蜜糖、植物蜜糖、乙酰氨基葡萄糖、肌醇、尿素、纖維雙糖、甲基葡萄糖、木質(zhì)醇、甘油、山梨醇、木蜜二糖、環(huán)已胺、硝酸鹽、酮基葡萄糖和福壽草醇。

2.菌株接種量：菌株在SDA上培養(yǎng)48小時(30℃)后，選取4個直徑在3mm左右的菌落，用1.8ml0.5%的鹽水稀釋，再用電子比濁器(BioMerieuxVitek,Inc,USA)調(diào)整其濃度為2個麥?zhǔn)蠁挝弧Ｈ缓笥梦軐⒕悍N入YBC中。

3.同化反應(yīng)終值判定：在30℃恒溫箱中培養(yǎng)48小時，放入AMS讀數(shù)器(BioMerieuxVitek,Inc,USA)中，讀數(shù)器按光學(xué)掃描原理，測定同化反應(yīng)池中指示劑的顯色及濁度，并通過計算機(jī)與預(yù)定的閾值相比較，高于閾值為陽性。

三、氨基黑染色法檢測白念珠菌蛋白酶分泌［2］

1.接種：菌株在SDA上培養(yǎng)24小時，然后以無菌生理鹽水制成菌懸液，通過電子比濁器調(diào)整其濃度在2個麥?zhǔn)蠁挝?。在牛血清白蛋?BAS)培養(yǎng)基(葡萄糖2%，酵母提取物0.01%，BAS0.20%，瓊脂2%)上，滴入10μl菌懸液。平皿在37℃培養(yǎng)48小時。

2.染色：將氨基黑染色液(氨基黑1g；醋酸鹽緩沖液900ml)輕輕倒入BAS培養(yǎng)基中，染色24小時后，棄去氨基黑染色液，并倒入染色洗滌液(蒸餾水830ml，醋酸20ml，甘油150ml)，每20分鐘換一次，直到不含蛋白質(zhì)部分的瓊脂褪色為止。

3.結(jié)果判定：從培養(yǎng)基底部進(jìn)行觀察，按Ruchel的方法對蛋白酶活力進(jìn)行分級［即，-或±：在菌落上無或極模糊地看見蛋白溶解；+：可明顯地看到蛋白溶解(1～2mm)；++：蛋白溶解已超過菌落的邊緣(3～5mm)］。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

對碳源同化結(jié)果進(jìn)行Fisher精確檢驗，蛋白酶分泌試驗結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗，以比較A組和B組的統(tǒng)計學(xué)差異。統(tǒng)計分析采用SAS軟件Version6.04(SASInstitute,Inc,USA)。根據(jù)碳源同化結(jié)果和蛋白酶分泌試驗結(jié)果對菌株間相似性的分析，由我們所編制的相應(yīng)程序完成［3］，并繪制樹狀圖。

結(jié)果

一、A、B兩組間陰道分離白念珠菌碳源同化的比較

半乳糖、蔗糖、麥芽糖、卟拉醇和葡萄糖A、B兩組碳源同化反應(yīng)均為陽性。乳糖、阿拉伯糖、落葉糖、衛(wèi)矛醇、紅鮮醇、肌醇和尿素A、B兩組碳源同化反應(yīng)均為陰性。纖維雙糖A組陽性0例，B組陽性6例；甲基葡萄糖A組陽性22例，B組陽性28例；木質(zhì)糖A組陽性20例，B組陽性24例；植物蜜糖A組陽性3例，B組陽性6例；閔蜜糖A組陽性17例，B組陽性24例；乙酰氨基葡萄糖A組陽性22例，B組陽性31例；木質(zhì)醇A組陽性20例，B組陽性28例；甘油A組陽性20例，B組陽性30例；山梨醇A組陽性19例，B組陽性29例；木蜜二糖A組陽性3例，B組陽性8例；環(huán)已胺A組陽性19例，B組陽性31例；硝酸鹽A組陽性4例，B組陽性3例；酮基葡萄糖A組陽性22例，B組陽性32例。這些碳源A、B兩組間均無顯著性差異(P＞0.05)。福壽草醇A組陽性7例，B組陽性29例，A、B兩組間存在顯著性差異(P＜0.05)。

二、A、B兩組間陰道分離白念珠菌分泌蛋白酶能力的比較

-或±級中A組10例，B組2例；+級中A組11例，B組12例；級中A組1例，B組19例。A、B兩組間存在顯著性差異(χ2=20.184，P＜0.01)。

三、A、B兩組間陰道分離白念珠菌菌株間相似性分析

由附圖可見，56株白念珠菌共產(chǎn)生41型，可大致分為7類，第c、f和g類以B組分離株為主，第b和d類以A組分離株為主。

*圖左側(cè)字母a～g為菌株分類，1～56為分離菌株編號

附圖56株白念珠菌菌株的樹狀圖

討論

陰道念珠菌病是一種常見的陰道炎癥。據(jù)統(tǒng)計，主訴白帶增多的非孕婦女中約10%及孕婦中1/3的陰道中有此菌寄生。本病多見于孕婦、糖尿病患者及接受大量雌激素治療者。如長期應(yīng)用抗生素，亦易使念珠菌得以繁殖而引起感染。近來研究發(fā)現(xiàn)表型或基因型不同的菌株產(chǎn)生的致病性也存在差異。

碳源同化試驗實質(zhì)是反映酵母菌株分解和利用相應(yīng)碳水化合物的能力，其原理在于酵母菌含有特異的酶系統(tǒng)，提供其利用碳水化合物作為培養(yǎng)基內(nèi)碳的唯一生長來源，同時分解該碳水化合物使培養(yǎng)基內(nèi)所含指示劑變色。Boerlin等［4］發(fā)現(xiàn)HIV陽性患者分離的白念珠菌被明顯的分為兩組：一組具有非典型的糖同化試驗結(jié)果，分離自無癥狀的HIV陽性吸毒者的口腔，毒力較弱；另一組缺乏β-葡萄糖酶活性，來自HIV陽性的念珠菌性食管炎和HIV陰性的侵襲性念珠菌病患者，毒力較強(qiáng)。AMS本身是酵母快速生化鑒定系統(tǒng)的一種，能自動的對結(jié)果進(jìn)行讀數(shù)和解釋，鑒于其能在相同碳源量、相同接種量、相同終值判別標(biāo)準(zhǔn)下分析的特點，我們將其引入白念珠菌的分型中。AMS技術(shù)具有重復(fù)性好，易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點。研究發(fā)現(xiàn)，福壽草醇在正常組與疾病組間有差異。此外，我們證實蛋白酶分泌能力兩組間存在差異，這與國外研究一致，進(jìn)一步證實蛋白酶中存在致病成分，如分泌型天冬氨酸蛋白酶。

菌株數(shù)值分類是從統(tǒng)計學(xué)角度對大量觀察數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使得觀察數(shù)據(jù)中所包含的信息得以盡可能多地釋放出來，對于資料的再利用是很有意義的。數(shù)值分類技術(shù)被認(rèn)為是臨床微生物學(xué)研究從定性走向定量的銳器。本研究中，56株白念珠菌共產(chǎn)生41型，可大致分為7類，一部分以疾病組分離株為主，另一部分以正常人分離株為主。從理論上，利用AMS技術(shù)對白念珠菌分型，可有226型，利用蛋白酶分泌差異，可有32型，兩者結(jié)合可有226×32型。

志謝西安醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院陳庭梅技師和王冬云醫(yī)師協(xié)助

本實驗在西安醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院完成

參考文獻(xiàn)

1秦振宇,譚升順,陳庭梅,等.18株白念珠菌26種生化反應(yīng)變異的研究.中國皮膚性病學(xué)雜志,1997,11∶133-134.

2CassoneA,DeBernardisF,MondelloF,etal.Evidenceforacorrelationbetweenproteinasesecretionandvulvovaginalcandidiasis.JInfectDis,1987,156∶777-784.

3秦振宇,譚升順,黨少農(nóng),等.菌株數(shù)值分類程序設(shè)計及其在白念珠菌菌株相似性分析中的初步應(yīng)用.中國皮膚性病學(xué)雜志,1997,11∶270-271.

4BoerlinP,Boerlin-PetzoldF,DurusselC,etal.ClusteroforalatypicalCandidaalbicansisolatesinagroupofhumanimmunodeficiencyvirus-positivedrugusers.JClinMicrobiol,1995,33∶1129-1135.

（責(zé)任編輯：zxwq）

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