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31P核磁共振在表皮磷脂檢測(cè)中的應(yīng)用

發(fā)布時(shí)間： 2016-07-11 18:15:06 來源：健康族

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31P核磁共振在表皮磷脂檢測(cè)中的應(yīng)用

中華皮膚科雜志1999年第3期第32卷技術(shù)與方法

作者：楊勤萍方麗王俠生李祖義

單位：楊勤萍方麗王俠生200040上海醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所；李祖義中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所

磷脂是生物膜的重要組成部分，對(duì)維持細(xì)胞的完整、保持生物膜的正常物理特性(細(xì)胞的粘附和流動(dòng))及細(xì)胞的正常代謝起重要作用[1，2]。對(duì)磷脂各組分的測(cè)定，可了解磷脂在表皮正常代謝及異常代謝中所發(fā)生的改變，探索精確的測(cè)定方法是關(guān)鍵所在。為此我們采用了31P核磁共振法和高效薄層掃描法對(duì)正常表皮的磷脂組分進(jìn)行了定性和定量分析，從而比較這2種檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為今后的脂質(zhì)分析提供了一種快速精確的方法。

一、材料和方法

(一)試劑和儀器：

1.脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品：磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、神經(jīng)鞘磷脂(SPH)、心磷脂(CL)和溶血卵磷脂(LPC)為Sigma公司產(chǎn)品。磷脂酸(PA)、卵磷脂(PC)為Supelco公司產(chǎn)品。

2.氯仿、氘代氯仿、甲醇、Dittmerlester鉬藍(lán)顯色劑等。

3.薄板：采用E.Merck,HPTLCSilicaGel60F254，德國(guó)產(chǎn)。

4.薄層掃描儀：日本島津CS－910型雙波長(zhǎng)薄層色譜掃描儀，配模擬積分器。

5.300兆核磁共振儀：瑞士Bruker公司產(chǎn)品，AM－300。

(二)對(duì)象及取材：正常人5例，均為男性，年齡28±12(22～41)歲。皮膚取自腹部，在室溫下，應(yīng)用解剖刀仔細(xì)刮除皮下脂肪，再刮薄真皮，然后將真皮層向下置于浸過0.3％胰蛋白酶去離子水的紗布上，放入清潔培養(yǎng)皿中，置于4℃冰箱保存22～23h，取出后用手術(shù)刀片輕輕一刮，表真皮分離，然后用氯仿∶甲醇(2∶1、v/v)抽提并純化、蒸干表皮脂質(zhì)。

(三)實(shí)驗(yàn)方法：

1.高效薄層掃描法：分別取上述脂質(zhì)約1mg左右溶于0.5mL氯仿∶甲醇(2∶1v/v)中，展開劑為氯仿∶甲醇∶水(65∶25∶4v/v)，顯色劑采用DittmerLester鉬藍(lán)顯色劑，底色為白色，磷脂斑點(diǎn)為藍(lán)色，用島津雙波長(zhǎng)薄層掃描儀，以波長(zhǎng)720nm作反射吸收光譜掃描，由模擬積分器打印出薄板上磷脂的峰面積及相對(duì)百分含量。

2.300兆核磁共振分析法：用柱層析法分別將上述多余表皮脂質(zhì)分離并純化磷脂，蒸干后溶于1mL氘代氯仿中，放入直徑為5mm標(biāo)準(zhǔn)核磁管中，化學(xué)位移以85％H3PO4及氘代氯仿為內(nèi)標(biāo)，低場(chǎng)為正，高場(chǎng)為負(fù)，測(cè)試溫度為20℃，濕度45％，根據(jù)31PNMR圖譜，由積分曲線的高度算出各種磷脂化合物的摩爾百分比(mol％P)。

二、結(jié)果

應(yīng)用高效薄層掃描法測(cè)定各組表皮磷脂百分含量，結(jié)果顯示PC含量最高，為41.76±6.53％，其余依次為SPH(22.83±3.8％)、PE(21.52±3.89％)、PI＋PS(12.17±2.29％，由于在單向薄層掃描中PI和PS的斑點(diǎn)重疊所致)。

應(yīng)用31PNMR方法測(cè)定正常人表皮磷脂各組成含量，以PC含量最高，為38.70±0.96％，其余依次為SPH(20.84±1.38)、PE(20.02±1.04)、PI(8.54±1.74)、CL(3.38±0.62)、PS(2.90±0.52)、PA(2.26±0.23)、LPC(1.46±0.24)，并出現(xiàn)一個(gè)未知磷脂(1.89±0.15)。

三、討論

本實(shí)驗(yàn)采用高效薄層掃描法測(cè)定磷脂的組成及含量，結(jié)果與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致[3]。而31PNMR方法應(yīng)用于皮膚磷脂的檢測(cè)，主要結(jié)果與高效薄層掃描法相近，但31PNMR尚可檢測(cè)到鉬藍(lán)溶液不能顯色的CL和PA，并能將PI和PS完全分開，還發(fā)現(xiàn)一個(gè)含量較少的未知磷脂，有待于今后進(jìn)一步研究證實(shí)。

高效薄層掃描法是以往最常用于脂質(zhì)分析的一種方法，它具有快速、靈敏和分析范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，且所需樣本量很少，一般僅需數(shù)10μg即可，但受較多條件的影響，如制備薄板硅膠的型號(hào)和均勻度，顯色后與掃描的時(shí)間差等，只有在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，才能得到較好的重復(fù)性，并且在定量測(cè)定中標(biāo)準(zhǔn)品不易得到。施邑屏等[4]曾對(duì)TLC法和31PNMR方法進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果提示前者準(zhǔn)確性和重復(fù)性不如后者，TCL的相對(duì)誤差為3左右，而31PNMR法一般為1.5以下。

31PNMR分析法是近年來發(fā)展起來的化學(xué)檢測(cè)手段，可用來測(cè)定不同結(jié)構(gòu)中P原子的化學(xué)位移以確定磷脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)，對(duì)被測(cè)樣品進(jìn)行定性及定量分析。它更具有快速、靈敏、干擾因素小，準(zhǔn)確性較高，深入物質(zhì)內(nèi)部而不破壞被測(cè)物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，從而極大地彌補(bǔ)了其它測(cè)定方法的缺點(diǎn)。但本法樣品純度要求高，樣品需要量較多，一般應(yīng)用90兆NMR儀測(cè)定需樣品30～60mg，用300兆NMR儀需10mg以上。

參考文獻(xiàn)

1WertzPW.Epidermallipids.SeminDermatol,1992,11:106－113.

2SchurerNY,PlewigG,EliasPM.Stratumcorneumlipidfunction.Dermatologica,1991,183:77－94.

3GragGM,YardleyHJ.Lipidcompositionsofcellsisolatedfrompig,humanandratepidermis.JLipidRes,1975,16:434－439.

4施邑屏，黎燕斌，孫玲玲，等.31P核磁共振光譜及薄層色譜分析針劑大豆卵磷脂.分析化學(xué),1991,19:733－736.

(收稿：1998－06－22修回：1998－12－26)

（責(zé)任編輯：zxwq）

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