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綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染角質(zhì)形成細胞的瞬時表達檢測

中華皮膚科雜志1999年第4期第32卷技術(shù)與方法

作者：廖文俊葉苓劉彥仿劉玉峰

單位：710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院皮膚科(廖文俊劉玉峰)；第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部病理學(xué)教研室(葉苓劉彥仿)

近來的研究已發(fā)現(xiàn)皮膚角質(zhì)形成細胞具有許多功能和活性，它不僅符合基因治療中靶細胞的基本條件，而且還具有許多優(yōu)點，如取材方便、易于回植、便于觀察和調(diào)控基因表達情況及副作用，因而，角質(zhì)形成細胞被認為是一種理想的靶細胞。為了證實角質(zhì)形成細胞作為基因轉(zhuǎn)染、基因表達及基因治療中靶細胞的可行性，本實驗將pEGFP-N3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染皮膚角質(zhì)形成細胞，并對其瞬時表達情況進行了檢測。

一、材料和方法

(一)實驗材料：質(zhì)粒：pEGFP-N3質(zhì)粒由本校病理學(xué)教研室趙利軍博士惠贈(ClontechLaboratones,Inc產(chǎn)品)，該質(zhì)粒在細胞內(nèi)表達后，可發(fā)出綠色熒光。主要試劑：角質(zhì)形成細胞無血清培養(yǎng)基(KC-SFM)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(LipofectamineTM)均為美國GibcoBRL公司產(chǎn)品。

(二)方法：

1.質(zhì)粒鑒定及制備：參照《分子克隆操作指南》中的堿裂解法提取質(zhì)粒[1]，取少量質(zhì)粒用NotⅠ、XhoⅠ做雙酶切，1％瓊脂糖電泳鑒定酶切結(jié)果。

2.角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)：取手術(shù)包皮(本校西京醫(yī)院門診手術(shù)室提供)用0.25％洗必泰液浸泡和無菌生理鹽水漂洗。用無菌眼科剪盡量剪去皮下組織，將皮片剪成0.3cm×1cm大小之皮塊，加0.25％Dispase5mL，置4℃消化過夜(約16h)。次日用無菌鑷分離真表皮，將表皮部分放入50mL離心管中，再用0.25％胰酶室溫消化10min，小心吸除上層胰酶，用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，并用吸管反復(fù)輕柔吹打，200目篩網(wǎng)過濾除渣，除去角質(zhì)層，收集液放入另一50mL離心管中，離心棄上清液，沉淀用DMEM培養(yǎng)液洗滌細胞2次，離心10min，以事先配制好的KCSFM制成細胞懸液，接種于鋪有蓋玻片的6孔板中(1×106)，置37℃培養(yǎng)至細胞生長達70％融合時進行基因轉(zhuǎn)染。

3.基因轉(zhuǎn)染(LipofectamineTM法)：參照LipofectamineTM試劑盒說明書進行。主要步驟如下：在無菌管中配制：溶液A：2μg質(zhì)粒(pEGFP-N3)溶于100μLOPTI-MEM培養(yǎng)液；溶液B：10μLLipofectamine溶于100μLOPTI-MEMI培養(yǎng)液?；旌先芤篈和溶液B，輕柔搖動，室溫放置30min后，加0.8mLKC-SFM，輕柔搖動。吸盡培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，將質(zhì)粒-Lipofectamine復(fù)合物覆蓋到細胞表面，置37℃孵箱中培養(yǎng)5h(其間每隔30min輕搖培養(yǎng)板)后，加2mL含20％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止反應(yīng)，18h后換成KC-SFM。分別于轉(zhuǎn)染后36h、48h、72h取出貼附細胞的蓋玻片進行檢測。實驗中設(shè)未轉(zhuǎn)染細胞做對照。

4.轉(zhuǎn)染pEGFP-N3細胞的熒光顯微鏡觀察：4％多聚甲醛(PBS配制)室溫固定30min后，PBS洗2次，在熒光顯微鏡下，488nm激發(fā)波長下觀察，表達pEGFP-N3的細胞發(fā)綠色熒光。

二、結(jié)果

1.酶切鑒定結(jié)果：pEGFP-N3經(jīng)XhoⅠ和NotⅠ雙酶切后，電泳顯示有一條700kb的片段和載體片段。證明所獲質(zhì)粒確為pEGFP-N3。

2.綠色熒光蛋白的表達：轉(zhuǎn)染后36h組即可見發(fā)綠色熒光的細胞，但強度較弱；48h組陽性細胞明顯增多，每個低倍視野(10×)可見2～5個，多為明亮的綠色熒光，少數(shù)發(fā)出弱熒光，主要集中在胞漿內(nèi)。72h組，發(fā)光細胞的熒光強度最強，且胞核也有熒光(圖1)。這些細胞多成堆或成對出現(xiàn)，有的區(qū)域可見8～10個聚集在一起的熒光細胞。未轉(zhuǎn)染細胞未見綠色熒光。

1轉(zhuǎn)染后72h角質(zhì)形成細胞表達EGFP(亮綠色熒光)

三、討論

來源于JellyfishAequoreaVictoria的綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)目前已被作為一種新型的報告分子用于檢測細胞的基因表達和蛋白定位。它在暴露于紫外線后即可發(fā)出明亮的綠色熒光，并可在熒光顯微鏡下觀察到這種綠色熒光[2]。GFP是一種由238個氨基酸組成的單體，相對分子質(zhì)量為27000。與其它發(fā)光性報告分子不同，GFP不需要另外的蛋白質(zhì)、底物或共同因子，但只有完整的GFP才能發(fā)出熒光。GFP熒光比較穩(wěn)定，無種系依賴性，表達GFP的活細胞經(jīng)甲醛固定后，綠色熒光可持續(xù)存在于細胞中。GFP已用于在從大腸桿菌到哺乳類動物的一系列細胞中進行表達，并被認為是一種適用于不同情況、不同領(lǐng)域基因表達研究的通用報告基因。

EGFP是一種最佳化的突變型GFP，其基因編碼序列含有190多個沉默堿基突變，結(jié)果產(chǎn)生一個更適合于在人類細胞中表達的開放讀框，而且EGFPmRNA的翻譯效率提高，EGFP的表達增強，所產(chǎn)生的熒光比野生型GFP強35倍。因而，這種報告分子更適用于檢測各類細胞中EGFP和EGFP融合蛋白的表達情況。

我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，pEGFP-N3在轉(zhuǎn)染角質(zhì)形成細胞后36h即開始表達，48h發(fā)光細胞明顯增多，但在表達水平上存在差異，多數(shù)細胞為強熒光，部分細胞僅發(fā)出弱熒光，表達細胞的數(shù)量及熒光強度均以轉(zhuǎn)染后72h為最高。我們還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后72h可觀察到成對出現(xiàn)的發(fā)光細胞，這一現(xiàn)象在Plautz等的文獻中曾有報道[3]，他們將GFPcDNA轉(zhuǎn)染GH3垂體瘤細胞系后，發(fā)現(xiàn)一些細胞發(fā)生分裂，對每個細胞中GFP的表達水平進行定量分析，結(jié)果顯示，瞬時轉(zhuǎn)染的細胞發(fā)生分裂后GFP也被分配到了兩個子代細胞中。由于只有完整性GFP才能發(fā)出綠色熒光，我們在實驗中成功表達EGFP，提示外源基因能在角質(zhì)形成細胞內(nèi)進行有效的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和正確的翻譯后修飾，且外源基因表達所需的一些調(diào)控元件也能在角質(zhì)形成細胞中有效地工作。我們的實驗說明：以角質(zhì)形成細胞作靶細胞進行基因轉(zhuǎn)染、基因表達的策略是可行的，并有望應(yīng)用于基因治療。

國家自然科學(xué)基金資助項目(39570656)

參考文獻

1SambrookJ,FritschEF,ManiatisT.分子克隆實驗指南.張勵，石立成，譯.第2版.北京：科學(xué)出版社,1992.17－34.

2YangTT,ChengLZ,KainSR.Optimizedcodonusageandchromophoremutationsprovideenhancedsensitivitywiththegreenfluorescentprotein.NucleicAcidsRes,1996,24:4592－4593.

3PlautzJD,DayRN,DaileyGM,etal.GreenfluorescentproteinanditsderivativesasversatilemarkersforgeneexpressioninlivingDrosophilamelanogaster,plantandmammaliancells.Gene,1996,173:83－87.

收稿：1998－08－11修回：1998－11－30

（責(zé)任編輯：zxwq）

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