乙肝病毒核心區(qū)基因變異與細胞免疫

李嘉朱理珉梁樹人李順天徐健【摘要】目的探討慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒（HBV）核心區(qū)Leu60Val變異與機體細胞免疫水平的關(guān)系。方法通過流式細胞分析技術(shù)（FCM）檢測外周血T淋巴細胞亞群，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清細胞因子［干擾素γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素2（IL-2）]水平，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增HBVDNAC基因區(qū)片段，并對PCR產(chǎn)物直接測序。結(jié)果91例慢性乙型肝炎患者發(fā)生Leu60Val變異者19例，變異率為20.9%，隨病情加重變異率逐漸增加，以重型肝炎組最高；Val60變異株組IFN-γ、TNF-α水平明顯增高（t值分別為2.584、4.766，P<0.01），CD4+/CD8+比值逐漸升高（t＝2.275，P<0.05）。結(jié)論Val60變異株可能通過增加與Ⅰ類人白細胞抗原（HLA-I）的親和力，或上調(diào)HLA-I類分子的表達，從而激活大量的細胞毒性T淋巴細胞釋放細胞因子，并同時在肝臟局部發(fā)揮免疫效應(yīng)，提高對宿主的殺傷力。

【關(guān)鍵詞】肝炎病毒，乙型；變異；細胞因子；T淋巴細胞亞群；序列

RelationshipbetweentheHBVcoregenemutationandthecellularimmunityinhostLIJia,ZHULi-min,LIANGShu-ren,LIShun-tian,XUJian.TianjinInfectiousDiseasesHospital,Tianjin300192,China【Abstract】ObjectiveTostudytherelationshipbetweenthemutationofLeu60ValinHBVcoreregionandthecellularimmunityinpatientswithchronichepatitisB(CHB).MethodsHBVDNACgenemutationwasconfirmedbypolymerasechainreaction(PCR)andsequencingtheproductsdirectly.Thecytokines(IFN-γ,TNF-αandIL-2)levelsinserumweremeasuredbyenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA).ThedistributionofT-lymphocytesubpopulationsinperipheralbloodwasdetectedbyflowcytometry(FCM).ResultsThemutationofLeu60Valwasfoundin19outofthe91CHBpatients.WiththeCHBseverity,themutationratewasgettinghigher,especiallyintheseverehepatitisgroup.TheIFN-γandTNF-αlevelsweremuchhigherinmutantstraingroupthanthoseinwildstraingroup(t=2.584,4.766,P<0.01),sowastheratioofCD4+/CD8+(t=2.275,P<0.05).ConclusionThemutantstrainof60ValmayincreaseaffinitytoHLA-Imolecule,orup-regulatetheexpressionofHLA-Imolecule,resultingintheactivationofCTLtoreleasethecytokinesandcauseimmuneresponseinliver.【Keywords】HepatitisBvirus;Mutation;Cytokines;T-lymphocytesubpopulations;Sequence

慢性乙型肝炎患者的肝細胞損傷主要是由于機體針對乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）發(fā)生的免疫反應(yīng)所引起，其中作為效應(yīng)細胞的CD8+細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxicTlymphocyte，CTL）是肝細胞發(fā)生病理損害的主要介導者，而針對HBV核心抗原（hepatitisBcoreantigen，HBcAg）的CTL應(yīng)答是決定病毒是否被清除的關(guān)鍵。當HBV基因發(fā)生變異，可以改變氨基酸分子的表達，尤其當CTL識別的重要表位發(fā)生變異會改變機體針對病毒的免疫反應(yīng)。本實驗通過對HBVDNAC基因區(qū)進行核苷酸序列分析，并同時檢測患者外周血T細胞亞群（CD4+、CD8+）及血清細胞因子水平［γ干擾素（interferonγ，INF-γ）、腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactorα，TNF-α）及白細胞介素2（interleukin2，IL-2）］，從而了解HBV核心區(qū)第60位亮氨酸變異為纈氨酸（Leu60Val）的情況及機體的免疫狀況，探討在慢性乙型肝炎中，HBV核心區(qū)Val60變異株與機體細胞免疫水平的關(guān)系。

資料與方法

1．病例選擇：病例為天津傳染病醫(yī)院1999年10月～2001年10月收治的91例慢性乙型肝炎患者，其中輕度21例，年齡（34.95±11.38）歲；中度24例，（36.05±13.45）歲；重度23例，（35.45±10.47）歲；重型肝炎23例，（39.71±12.20）歲。血清甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒血清學標志檢測均陰性。診斷符合符合2000年西安修訂的病毒性肝炎診斷標準[1]。

2．HBVDNAC基因區(qū)擴增及序列分析：根據(jù)GeneBank公布的31條HBV全基因序列，選取C基因區(qū)兩端保守區(qū)域，設(shè)計合成2條特異性引物（C1和C2）進行PCR擴增，并經(jīng)Pcrdesn軟件進行檢驗，測序引物為C3。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物C15′-TGGAGACCACCGTGAACGCC-3′（nt1609～1628），C25′-AAAGACAGGTACAGTAGAAG-3′（nt2516～2497），C35′-GGCGAGGGAGTTCTTCTTCTAGGGG-3′（nt2364～2388）。dNTP為美國Gibco公司產(chǎn)品，TaqDNA聚合酶、Tris飽和酚購于北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心，DNA測序試劑盒為加拿大VisibleGenetic公司的末端標記試劑盒及OpenGene自動DNA測序儀和Version3.0進行DNA測序電泳及序列分析。提取血清DNA，采用PCR擴增HBVDNAC區(qū)基因，電泳后在紫外光下檢測PCR產(chǎn)物，采用瓊脂糖凝膠電泳回收法回收產(chǎn)物，并進行產(chǎn)物的純化，采用雙脫氧鏈末端終止法進行測序反應(yīng)，對測序產(chǎn)物純化后進行測序電泳。

3．血清細胞因子檢測：IFN-γ、TNF-α和IL-2試劑盒購自美國Gibco公司。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測，一抗為生物化學抗體，二抗為辣根過氧化物酶標記的streptavidin，用標準品繪制曲線并計算429nm吸光度時標本濃度。

4．外周血T細胞亞群的檢測：采用流式細胞術(shù)，選用三色熒光標記的免洗試劑（TriTESTTMCD4FITC+CD8PE+CD3PerCP）直接熒光染色。熒光標記試劑、紅細胞裂解液及同型對照均為美國BD公司的產(chǎn)品。取抗凝血1ml，先將白細胞數(shù)調(diào)至（4.0～10）×109/L，在管底部加入CD3/CD4/CD8三色直標熒光抗體20μl和混勻的肝素抗凝血100μl，徹底混勻后室溫避光30min。加１×紅細胞裂解液1ml于試管內(nèi)充分混勻，室溫避光保存15min，上機檢測。

5.統(tǒng)計學處理：各組間率的比較用χ2檢驗，各組間均數(shù)比較用t檢驗，方差分析用F檢驗。

結(jié)果

1.HBV核心區(qū)第60位氨基酸（aa60）變異情況：參照我國HBV流行株（C基因型）標準序列[2]，進行核酸序列對齊比較。91例慢性乙型肝炎患者中19例（20.9%）發(fā)生aa60變異，為亮氨酸Leu被纈氨酸Val替代（即第2078位核苷酸C被G替代）。其中慢性輕度3例（14.3%)，中度4例(16.7%)，重度5例(21.7%)，重型7例(30.4%)。提示隨病情加重aa60變異率增加，以重型肝炎組最高。

2．將慢性肝炎患者分為aa60變異株組和aa60野生株組，分別比較二組之間細胞因子水平、T細胞亞群分布的變化情況，aa60變異株組IFN-γ、TNF-α及IL-2水平均高于野生株組，其中變異株組的IFN-γ及TNF-α水平分別與野生株組比較，差異有顯著性；同時變異株組CD4+相對數(shù)及CD4+/CD8+比值高于野生株組，CD8+相對數(shù)明顯低于野生株組，其中CD4+/CD8+比值差異有顯著性（表1、2）。

表1aa60變異株組和野生株組血清細胞因子水平的比較（x-±s，pg/ml）組別例數(shù)IFN-γTNF-αIL-2變異株組1953.3±14.8**50.1±10.3*31.6±13.3野生株組7241.1±19.035.6±16.129.5±15.2IFN-γ：γ干擾素；TNF-α：腫瘤壞死因子α；IL-2：白細胞介素-2；與野生株組比較，*t′TNF-α=4.766，P<0.05；**tIFN-γ=2.584，P<0.01，tIL-2=0.553,P<0.01表2aa60變異株組和野生株組外周血T細胞亞群分布的比較（x-±s，%)組別例數(shù)CD4+CD8+CD4+/CD8+變異株組1947.1±11.129.8±10.01.8±0.5野生株組7245.9±14.235.0±16.21.4±0.7tCD4+=0.341，t′CD8+=1.731，tCD4+/CD8+=2.275，P<0.05

討論

HBV本身并不直接損傷肝細胞，病毒所激發(fā)的免疫應(yīng)答和免疫病理反應(yīng)才是乙型肝炎發(fā)病的關(guān)鍵，其中CTL是細胞免疫反應(yīng)的主要執(zhí)行者，是徹底清除HBV的決定因素[3，4]。

CTL可以通過分泌包括TNF-α和IFN-γ在內(nèi)的多種具有抗病毒作用的細胞因子[5，6]發(fā)揮免疫效應(yīng)。其中IFN-γ具有活化CD4+、CD8+及NK細胞殺傷肝細胞的作用，是抗病毒防御效應(yīng)的重要機制；而TNF-α則與肝細胞的壞死密切相關(guān)。因此CTL被活化后在發(fā)揮抗病毒效應(yīng)時還能引起肝細胞的損傷甚至嚴重的肝衰竭。

目前國內(nèi)關(guān)于HBV核心區(qū)基因變異的研究多集中在前C區(qū)A1896變異，有關(guān)C基因區(qū)變異及這些變異與機體細胞免疫水平關(guān)系的研究則鮮見報道。HBV核心區(qū)包含有多個T細胞識別的表位，其中aa48～60是重要表位之一，而aa60正位于其中（編碼核苷酸為nt2078～2080）。本實驗通過對HBVDNAC基因區(qū)進行核苷酸序列分析，并同時檢測患者外周血T細胞亞群及血清細胞因子水平，從而了解HBV核心區(qū)第60位氨基酸的變異情況及機體的細胞免疫狀況，探討在慢性乙型肝炎中HBV核心區(qū)aa60變異與機體細胞免疫水平的關(guān)系。實驗數(shù)據(jù)顯示Val60變異株在各慢性肝炎組均存在，且隨著病情加重變異率有升高趨勢，以重型肝炎組最高（但由于樣本數(shù)少統(tǒng)計學分析差異無顯著性）。同時變異株組IFN-γ、TNF-α水平明顯增高，CD4+/CD8+比值逐漸升高，提示Val60變異株與病情加重和免疫功能異常密切相關(guān)。

Leu60Val變異與肝臟疾病的進展有關(guān)[7]。在機體的免疫應(yīng)答中，T細胞對多肽的識別主要集中在一個殘基，它是T細胞反應(yīng)的關(guān)鍵，僅僅單個氨基酸的改變，便可以影響抗原與HLA-I類分子的結(jié)合力，或改變TCR的識別效率；大多數(shù)突變分子的多肽結(jié)合能力有一定下降，但少數(shù)突變分子的結(jié)合能力卻可以顯著增加[8]。本實驗結(jié)果顯示單個氨基酸殘基的改變與疾病程度和免疫功能異常有明顯相關(guān)性，提示可能是Val60變異株能夠增加與HLA-I類分子的親和力，或增強HLA-I類分子的表達，從而提高了CTL對宿主的殺傷力，臨床表現(xiàn)為血清細胞因子水平及外周血T細胞亞群分布的變化。實驗中還發(fā)現(xiàn)Val60變異株組還伴有CD8+細胞相對數(shù)明顯下降及CD4+/CD8+比值升高。Webster等[9]實驗發(fā)現(xiàn)在丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanineamino-transferase，ALT）升高與不升高的慢性乙型肝炎患者的肝組織中HBV特異性CTL的數(shù)量沒有差異，但ALT升高組的肝組織中T細胞的總數(shù)大大增加；而Maini等[10]提出慢性乙型肝炎患者的肝損害可能是由肝外聚集而來的特異性和非特異性的CD8+細胞。本實驗結(jié)果顯示Val60變異株可能增加了與HLA-I類分子的親和力，或增強HLA-I類分子的表達，從而大大增強了CTL的活化增殖，在分泌較多數(shù)量IFN-γ、TNF-α的同時，眾多CTL細胞聚集到肝臟中發(fā)揮免疫效應(yīng)，損傷大量HBV感染的肝細胞。

變異的HBV病毒可能通過各種途徑改變機體的免疫應(yīng)答，引起HBV的持續(xù)感染或肝細胞損傷，甚至肝衰竭。因此同時監(jiān)測HBV變異情況及機體免疫狀況，有助于了解二者的相關(guān)性，為進一步闡明二者的因果關(guān)系提供依據(jù)。

參考文獻1中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會.病毒性肝炎防治方案.中華肝臟病雜志,2000,8:324-329.2郭亞兵,侯金林,戴煒，等.乙型肝炎病毒中國株全基因參照序列初步建立.中華微生物學和免疫學雜志,1999,19:197-200.3FerrariC,PennaA,BertolettiA,etal.CellularimmuneresponsetohepatitisBvirus-encodedantigensinacuteandchronichepatitisBvirusinfection.JImmunol,1990,145:3442-3449.4MilichDR,McLachlanA,MoriartyA,etal.ImmuneresponsetohepatitisBviruscoreantigen(HBcAg):localizationofTcellrecognitionsiteswithinHBcAg/HBeAg.JImmunol,1987,139:1223-1231.5PrezziC,CasciaroMA,FrancavillaV,etal.Virus-specificCD8(+)Tcellswithtype1ortype2cytokineprofilearerelatedtodifferentdiseaseactivityinchronichepatitisCvirusinfection.EurJImmunol,2001,31:894-906.6TomarasGD,GreenbergML.CD8+TcellmediatednoncytolyticinhibitionofhumanimmunodeficiencyvirustypeI.FrontBiosci,2001,6:575-598.7駱抗先，主編.乙型肝炎基礎(chǔ)和臨床.北京:人民衛(wèi)生出版社,2001.65.8余傳霖,葉天星,陸德源,主編.現(xiàn)代醫(yī)學免疫學.上海:上海醫(yī)科大學出版社,1998.217.9WebsterGJ,ReignatS,MainiMK,etal.IncubationphaseofacutehepatitisBinman:dynamicofcellularimmunemechanisms.Hepatology,2000,32:1117-1124.10MainiMK,BoniC,LeeCK,etal.Theroleofvirus-specificCD8(+)cellsinliverdamageandviralcontrolduringpersistenthepatitisBvirusinfection.JExpMed,2000,191:1269-1280.（收稿日期：2002-07-29）（本文編輯：金生）作者單位：300192天津市傳染病醫(yī)院李嘉女，34歲，醫(yī)學碩士，主治醫(yī)師。

（責任編輯：zxwq）